Home

Experimentele evolutie met pieken en dalen

Omdat micro-organismen heel snel evolueren, is het mogelijk hun evolutie tot in detail te bestuderen. Zo kun je bijvoorbeeld kijken naar de invloed van de omgeving op het verloop van de evolutie. In het onderzoek van Dr. Arjan de Visser wordt de omgeving van de micro-organismen gevormd door het flesje of de petrischaal waarin ze leven. Flesje of petrischaal, voor de micro-organismen is dat een wereld van verschil. Het verloop van hun evolutie wordt er door beÔnvloed. Een petrischaal als omgeving houdt biodiversiteit in stand en zorgt voor een toevalliger verloop van evolutie, blijkt uit het onderzoek.

Dr. Arjan de Visser

Bij de vakgroep evolutionaire genetica van de Wageningen Universiteit doet Arjan de Visser aan experimentele evolutie met micro-organismen. Evolutie waarvoor de onderzoeker zelf het startsein geeft en die hij rechtstreeks kan volgen en zelfs sturen. Waarbij hij voorouders tot leven wekt om ze te vergelijken met hun geŽvolueerde nakomelingen.

Evolutie in een flesje
Een simpel modelsysteem om evolutie te bestuderen bestaat uit een flesje met bacteriŽn in groeimedium (vloeistof met voedingsstoffen). In het flesje vindt voortdurend competitie plaats tussen de bacteriŽn. Soms krijgt een bacterie, als gevolg van een voordelige mutatie, een hogere fitness. Fitness is een maat voor het voortplantingssucces van een organisme. De bacterie met hoge fitness krijgt meer nakomelingen dan de bacteriŽn zonder voordelige mutatie, waardoor het aandeel bacteriŽn met de voordelige mutatie toeneemt binnen de populatie. Hetzelfde gebeurt steeds weer bij nieuwe voordelige mutaties. Door dit proces van adaptatie (letterlijk: aanpassing) raakt de populatie steeds beter aangepast aan het leven in het flesje.

Elke dag wordt een deel van de populatie overgezet naar een nieuw flesje met vers medium. Dat is nodig omdat de voedingsstoffen opraken en het flesje overbevolkt raakt. In het nieuwe flesje gaat het proces van adaptatie gewoon door.

Evolutie in een flesje is een voorbeeld van experimentele evolutie met micro-organismen. Bij experimentele evolutie worden experimenten uitgevoerd om theorieŽn en ideeŽn over het verloop van evolutie te testen. Micro-organismen zijn daarbij erg handig. Ze delen zich voortdurend en brengen dus snel grote aantallen generaties voort en vormen grote populaties. Bacterien stellen weinig eisen aan omgeving en je kunt er gemakkelijk dingen genetisch in analyseren en veranderen (bijvoorbeeld door mutaties op te wekken of door vreemd DNA in te brengen). Maar misschien wel het grootste voordeel vertelt Dr. Arjan de Visser enthousiast, is dat je een soort fossielenbank kunt opbouwen in de diepvries.

Levende fossielen
BacteriŽn die niet meegaan naar een nieuw flesje, kunnen in de diepvries bewaard worden als een soort fossielen. Uiteindelijk is dan het hele proces van adaptatie opgeslagen in de diepvries, beginnend bij de oorspronkelijke populatie van voorouders gevolgd door monsters uit latere flesjes. Een soort fossielenbank dus, maar dan ťťn waarvan je de fossielen weer tot leven kunt brengen.

De ingevroren voorouders kunnen na ontdooiing gebruikt worden in een competitie experiment. Eerst mogen ze groeien in een rijk medium en een dagje wennen aan de omgeving. Daarna, bij het competitie experiment, worden de voorouders samen met hun geŽvolueerde nakomelingen in ťťn flesje gestopt. Welke populatie wordt dan groter, en hoe snel gaat dat? Op deze manier meet je de fitness van de geŽvolueerde nakomeling ten opzichte van de voorouder.

De Visser vergelijkt zon competitie experiment wel eens met een voetbalwedstrijd tussen Neanderthalers en moderne mensen. De Neanderthalers komen uit de diepvries, krijgen wat te eten en mogen een paar dagen wennen aan het huidige klimaat. Vervolgens worden ze op een voetbalveld gezet samen met een groepje moderne mensen. Kijken wat er gebeurt.

Schematische weergave van experimentele evolutie.

Een simpel model wordt realistischer
Een flesje met bacteriŽn is dus een simpel modelsysteem. Te simpel voor de werkelijkheid. Een belangrijk verschil tussen het flesje en de natuur zit in de structuur van de omgeving. Doordat de flesjes steeds geschud worden, zijn de condities binnenin elk flesje homogeen. In de natuur is dat anders: zelfs micro-organismen die in zee of zoet water leven zijn meestal niet helemaal gemengd. Ze zitten vaak vast aan stukjes plantenmateriaal. In het water kan bovendien een soort gelaagdheid (stratificatie) bestaan door verschillen in bijvoorbeeld zuurstofconcentratie (hoe dieper, hoe minder zuurstof). Een natuurlijke omgeving is dus gestructureerd, niet homogeen.

Eťn manier om de condities waarin experimentele evolutie wordt gedaan wat realistischer te maken, is dus het aanbrengen van ruimtelijke structuur in de omgeving van de organismen, vertelt De Visser. Kijken wat dat doet met de evolutie.

Dat gestructureerde milieu ontstaat in een petrischaaltje. In het petrischaaltje wordt agar (een soort gelei) gegoten, met dezelfde voedingsstoffen als het vloeibare medium in de flesjes. De agar stolt en vormt zo een plaat waar de populatie organismen op uitgestreken wordt. Omdat er organismen worden gebruikt die zich niet kunnen verplaatsen, hebben ze een vaste plek. Ze houden steeds dezelfde buren. Zo ontstaat er structuur in de populatie. Het overplaatsen naar een nieuwe plaat, wat elke dag moet gebeuren, wordt gedaan met een soort stempel van een fluwelen lapje. Dat wordt voorzichtig op de plaat gedrukt, waarbij er organismen aan het lapje blijven kleven. Die worden op een nieuw plaatje gestempeld. De structuur van de populatie blijft zo grofweg in stand.

BacteriŽn op een petrischaal.

Om te onderzoeken wat het effect van ruimtelijke structuur is op het verloop van de evolutie bij micro-organismen, vergelijkt De Visser en zijn medewerkers evolutie in een homogeen milieu met evolutie in een gestructureerd milieu. Met andere woorden: hij vergelijkt evolutie in een flesje met evolutie op een plaat.

Giftige gisten
Zo heeft een medewerker van De Visser gekeken naar het effect van ruimtelijke structuur op de competitie tussen killers en sensitieve giststammen. Killers zijn gistcellen die gifstoffen kunnen produceren. Zelf zijn de killers immuun voor die gifstoffen maar andere gistcellen, de sensitieven, gaan er dood aan. Het is een soort chemische oorlogsvoering tussen gisten. Voor de killers heeft het maken van gif een dubbel voordeel: het schakelt directe competitie uit, en het zorgt voor extra voedingsstoffen die vrijkomen uit gedode sensitieven. Er is ook een nadeel: het maken van gif kost energie. Killers groeien daarom wat langzamer dan sensitieven.

De vraag is wat er gebeurt wanneer er een paar killers worden geÔntroduceerd in een populatie van sensitieven. Zouden de killers kunnen binnendringen in de populatie?

Op een plaat bleken ze dat te kunnen. De killers maakten gif en doordat de gevoelige cellen om hen heen stierven, maakten ze ruimte voor zichzelf om in aantal toe te kunnen nemen.

In het flesje maakten de killercellen ook ruimte, maar niet alleen voor zichzelf. Door het schudden van het flesje werd de extra ruimte gelijkmatig over het hele flesje verdeeld. De sensitieven die nog in leven waren, kregen zo dus ook meer ruimte. Die hebben dan net zoveel voordeel van het doden van andere sensitieven als de killers, waardoor het de killers niet lukt om binnen te dringen in de populatie. Chemische oorlogsvoering tussen gisten werkt dus alleen in een ruimtelijk gestructureerd milieu.

De chemische oorlogsvoering is een voorbeeld van interference competitie, rechtstreekse competitie. Je hebt ook resource competitie, waarbij de competitie via voedsel gaat. Dan gaat het erom wie het snelste voedsel kan omzetten in nakomelingen. Ook bij resource competitie maakt het uit of de omgeving gestructureerd of homogeen is, blijkt uit onderzoek met bacteriŽn.

In competitie met je eigen familie
Een bacterie die niet kan bewegen, die geen flagellen heeft, ligt op een agar bodem altijd naast zijn familieleden. De bacteriŽn vormen een soort aaneengesloten kolonie, een patch. Aan de randen van die patch zijn ze in competitie met bacteriŽn van een andere patch, maar binnenin de patch zijn ze in competitie met elkaar, met familieleden. Hebben ze een voordelige mutatie, dan zijn ze in het voordeel bij de competitie aan de rand, maar niet bij de competitie met familieleden. Want die hebben allemaal dezelfde voordelige mutatie. Naarmate de patch groeit, is er steeds meer competitie binnen de patch en minder aan de rand, omdat de verhouding omtrek : oppervlak kleiner wordt. Dat is niet efficiŽnt. In een ruimtelijk gestructureerd milieu verloopt de resource competitie dus steeds minder efficiŽnt, waardoor de snelheid van adaptatie achteruit gaat. In een niet-gestructureerde omgeving kan een voordelige mutatie zich veel sneller over de populatie verspreiden.

Geen winnaars
Ruimtelijke structuur heeft ook invloed op de biodiversiteit van een populatie. In populaties die op een plaat groeien, blijven meerdere varianten bestaan. Er is niet ťťn bacterie die de hele plaat overneemt. BacteriŽn afkomstig uit die populaties zijn wel aangepast aan het milieu, blijkt uit competitie experimenten waarin ze hun voorouders verslaan. Maar hoe meer er van dezelfde, genetisch identieke, bacteriŽn in de populatie zijn, hoe minder voordeel die bepaalde bacteriŽn hebben. Hun fitness voordeel is frequentie afhankelijk: het bestaat alleen als weinig individuen dezelfde voordelige eigenschap hebben.

Een verklaring daarvoor is dat de bacteriŽn zich gespecialiseerd hebben in hun eigen niche. Ze hebben voordeel omdat zij iets gebruiken, wat anderen niet kunnen gebruiken. Ze nemen bijvoorbeeld een ruimte in waar anderen niet bij kunnen, of ze leven van voedingsstoffen die andere bacteriŽn niet kunnen verteren. Als ze met velen zijn, raakt hun niche gevuld. De ruimte is bezet, de voedingsstof raakt op. Dan hebben ze dus geen voordeel meer over de anderen. Als niche specialist heb je dus voordeel zolang je zeldzaam bent.

Zo blijven er veel verschillende bacteriŽn bestaan, die eigenlijk allemaal zeldzaam zijn. Dat leidt tot een soort stabiele handhaving van de biodiversiteit.

Waarschijnlijk zijn er in een gestructureerd milieu meer mogelijkheden voor niche specialisatie dan in een homogeen milieu, zodat er in een gestructureerd milieu meer biodiversiteit kan bestaan.

Klein en driftig
Een laatste effect van ruimtelijke structuur waar De Visser over vertelt, is het effect op de rol van toeval in evolutie. Op een plaat wordt de gehele bacteriepopulatie eigenlijk vanzelf verdeeld in allemaal kleine groepjes, subpopulaties. Die subpopulaties komen nauwelijks in contact met elkaar. BacteriŽn in een fles worden juist continu gemengd, waardoor ze altijd ťťn grote populatie blijven vormen, waarin iedereen met iedereen in competitie is.

Nu is het zo, dat evolutie in kleine populaties veel onvoorspelbaarder is dan evolutie in een grote populatie. In kleine populaties is er een grotere rol voor genetischedrift: toevallige veranderingen in de frequentie van genen waarbij fitness geen duidelijke invloed heeft. In een gestructureerd milieu met apart van elkaar evoluŽrende subpopulatietjes is de rol van toeval dus ook groter dan in een homogeen milieu waar evolutie plaatsvindt in ťťn grote populatie.

Ruimtelijke structuur heeft dus een aantal verrassende effecten: het maakt resource competitie inefficiŽnt en houdt biodiversiteit in stand. Door de verdeling in subpopulaties maakt het chemische oorlogsvoering tussen gisten mogelijk en vergroot het de rol van toeval tijdens evolutie.

Een pad van mutaties langs pieken en dalen
Waarom is de rol van toeval eigenlijk groter in kleine populaties? Dat kan uitgelegd worden door de adaptatie van een populatie te vergelijken met een weg door een landschap met pieken en dalen. Een piek staat voor hoge fitness, een dal voor lage fitness. Om op een piek te komen moeten een aantal stappen gezet worden. Die stappen zijn mutaties. Er leidt dus een pad van opeenvolgende mutaties naar een piek van hoge fitness.

Een populatie bestaat uit bacteriŽn waarin mutaties plaatsvinden. Die mutaties kun je zien als stapjes in verschillende richtingen in het landschap. De bacterie die de grootste stap omhoog doet, heeft een groot fitness voordeel en dus de meeste nakomelingen. Hij neemt de populatie over: de populatie heeft dan een stap gezet in het fitness landschap.

Die grootste stap omhoog, de mutatie met het grootste voordeel, is zeldzaam. Maar als een populatie voldoende groot is, dan is er vast wel een bacterie die zon mutatie krijgt en de stap kan zetten. In een kleinere populatie gebeurt dat niet zo snel. Als niemand van de kleine populatie de grootst mogelijke stap zet, wint een bacterie die een kleinere stap zet. De route van adaptatie gaat dan via een minder steile weg die moeilijk te voorspellen is, omdat er veel meer mogelijkheden zijn. In kleine populaties is de rol van kans dus groter.†

Grote populaties lijken inderdaad wat vaker eenzelfde weg door het landschap af te leggen dan kleine populaties. De grote populaties rennen vaak de steilste dichtstbijzijnde helling op, terwijl kleine populaties verschillende richtingen op kunnen gaan. Daarbij hebben De Visser en zijn medewerkers iets verrassends gevonden: af en toe komen de kleine populaties op een helling terecht die weliswaar in eerste instantie misschien wat minder steil is, maar die uiteindelijk wel bij een hogere piek uitkomt. Soms bereikt een kleine populatie uiteindelijk een hogere fitness dan een grote populatie.

Het verschil tussen kleine en grote populaties in een fitnesslandschap.

De weg van softe naar harde theorie
Het in kaart brengen van fitness landschappen helpt evolutie beter voorspelbaar te maken. Dat toewerken naar evolutionaire voorspellingen is een persoonlijke drijfveer van De Visser. Eťn kritiek op de evolutietheorie is toch dat het een volledig softe theorie is. Door terug te kijken kun je het hele proces van evolutie verklaren in grote lijnen. Maar je kunt niet, zoals bij een harde theorie, bij natuurkunde bijvoorbeeld, de uikomst van het proces voorspellen. Willen we echt naar een harde evolutietheorie, willen we het echt goed begrijpen, dan moeten we toch gaan werken richting korte-termijn voorspellingen binnen evolutie.

Volgens De Visser kan de herhaalbaarheid - en dus de voorspelbaarheid - van de eerste stappen van evolutie vergroot worden door sterke selectie, grote populaties en hoge mutatiesnelheden.

Rennen door het landschap met in vitro evolutie
Als twee populaties op dezelfde fitness uitkomen, dan weet je nog niet of ze ook dezelfde route hebben gevolgd. Er zijn vaak meerdere mutaties die tot hetzelfde fenotype (dezelfde fitness) aanleiding geven. Bij in vitro evolutie kun je evolutie wel op DNA niveau volgen, en kijken of de mutaties hetzelfde zijn of niet.

Je kijkt dan naar evolutie van ťťn enkel enzym. Omdat je alleen maar mutaties in ťťn gen introduceert, kan dat met mutatiesnelheden die een levend organisme nooit zou overleven. Als je in het hele genoom diezelfde mutatiesnelheid zou gebruiken, dan zou je altijd wel ergens een letale (dodelijke) hit krijgen. De hoge mutatiesnelheid wordt bereikt door gebruik te maken van PCR (polymerase chain reaction).

PCR is een techniek om een gen een heleboel keer te kopiŽren. Normaal wil je natuurlijk dat dat heel precies gebeurt, zodat alle kopieŽn hetzelfde zijn. Maar bij in vitro evolutie wil je juist dat er veel fouten worden gemaakt. Dus gebruik je een slordig kopieer apparaat, een sloppy polymerase. De kopieŽn met fouten zijn genen met mutaties, waarvan sommige toevallig een verbetering betekenen.

Met behulp van in vitro evolutie bestudeert De Visser de evolutie van -lactamase. -lactamase is een enzym dat bepaalde klassen van antibiotica, zoals penicilline en ampicilline, kan afbreken. Dus als je dat enzym hebt, als bacterie, dan ben je resistent tegen die antibiotica. Maar je bent nog niet resistent tegen de meer synthetische antibiotica, zoals cefotaxime. Om resistentie tegen cefotaxime te ontwikkelen zijn enkele mutaties in het -lactamase gen nodig. De vraag is: Hoe vaak gaat de weg van penicilline resistentie naar cefotaxime resistentie via dezelfde route, en hoe vaak via een andere route?

Om daar antwoord op te krijgen, wordt het lactamase gen met PCR gemuteerd. De gemuteerde genen worden ingebouwd in bacteriŽn. Daarna wordt de mate van resistentie tegen cefotaxime gemeten door de bacteriŽn in een gradiŽnt van antibiotica te brengen en te kijken waar ze nog kunnen groeien.

In een eerste experiment bleek dat de meeste geselecteerde enzymen eenzelfde soort mutatie-route volgden. Ze ontwikkelden een hele hoge resistentie tegen cefotaxime. De twee of drie afwijkende lijnen die ontwikkelden een wat lagere resistentie, die op het laatst ook niet meer veranderde. De evolutie van cefotaxime resistentie lijkt dus een landschap met twee verschillende pieken te verkennen.

Antibioticum resistentie is een groot probleem in de medische wereld. Er zijn landen waar veel te scheutig met antibioticum wordt omgegaan. In Zuid-Europa heb je allerlei resistente varianten van bacteriŽn die ook, doordat mensen zoveel reizen, in Nederland voorkomen. Dus het begrijpen van de condities waaronder antibioticum resistentie optreedt is heel belangrijk.

Auteur: Elisa Carolus, Wageningen Universiteit